PCR หรือปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรส, เป็นเครื่องมือทางเทคโนโลยีชีวภาพในการขยายยีนที่น่าสนใจ. Simple PCR ใช้สำหรับตรวจจับและขยายยีน. มีวิธีการขั้นสูงของ PCR หลายวิธี, ซึ่งใช้สำหรับเทคโนโลยีชีวภาพต่างๆ, วัตถุประสงค์ในการวินิจฉัยและการวิจัย. qPCR หรือ PCR เชิงปริมาณเป็นที่รู้จักกันว่า PCR แบบเรียลไทม์. qPCR ใช้ในการหาปริมาณกรดนิวคลีอิก. สามารถตรวจสอบการขยายตัวของโมเลกุล DNA ได้ในระหว่าง PCR, เช่น. ในเวลาจริง. RT-PCR ถูกอ้างถึงเป็นปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรสของการถอดความแบบย้อนกลับ. มันใช้ทั้งสองกระบวนการ, เช่น. การถอดความแบบย้อนกลับและปฏิกิริยาลูกโซ่โพลิเมอเรส. ใช้ในการตรวจจับและวัดปริมาณของ RNA.
ผู้คนมักสับสนกับคำว่า PCR, อาร์.ที.พีซีอาร์, และ QPCR เหมือนเดิม. แต่พวกเขาไม่เหมือนกัน. อย่างไรก็ตาม, หลักการสำคัญในทั้งสามประเภทยังคงเหมือนเดิม. ก่อนจะไปถึงความแตกต่างของ PCR ทั้ง 3 แบบ, เราควรรู้ว่าจริงๆแล้วมันคืออะไร?
พีซีอาร์คืออะไร?
ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลิเมอเรสหรือ PCR ใช้เพื่อขยายหรือสร้างสำเนาของยีนหรือ DNA ที่ยืดสั้นหลายชุด. มันถูกคิดค้นโดย Kary Mullis. เทคนิคนี้เป็นเครื่องมือที่มีประโยชน์มากในด้านอณูชีววิทยาและเทคโนโลยีชีวภาพ. ใช้ในห้องแล็บเพื่อสร้างสำเนาดีเอ็นเอหลายพันล้านชุดสำหรับการวิจัยและการวินิจฉัย. มีสามขั้นตอนใน PCR: การเสียสภาพธรรมชาติ, การหลอมไพรเมอร์และการขยายไพรเมอร์.
ต้องใช้ไพรเมอร์สองชุดเสริมที่ปลายทั้งสองของแม่แบบ DNA และ DNA polymerase ที่ทนความร้อน. วงจรโพลีเมอเรสซ้ำแล้วซ้ำอีกเพื่อให้ได้สำเนาของส่วนดีเอ็นเอหลายชุด.
ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรสสามขั้นตอนคือ:
การเสียสภาพธรรมชาติ: ในขั้นตอนนี้, DNA ที่มีเกลียวคู่จะถูกแยกออกจากกัน. DNA สายเดี่ยวถูกสร้างขึ้น.
การหลอม: อุณหภูมิในการทำปฏิกิริยาจะลดลงเพื่อให้การจับคู่ฐานเสริมและการหลอมไพรเมอร์.
การขยาย: แท็กพอลิเมอเรส, ซึ่งเป็น DNA polymerase ที่ทนความร้อนได้, เป็นที่นิยมใช้เพื่อการนี้. DNA polymerase เพิ่มนิวคลีโอไทด์ให้กับไพรเมอร์และขยายสายเสริมในทิศทาง 5'-3'.
คิวพีซีอาร์คืออะไร?
qPCR หรือ PCR เชิงปริมาณเรียกอีกอย่างว่า PCR แบบเรียลไทม์. ให้การวิเคราะห์เชิงปริมาณเพิ่มเติมของ DNA หรือ RNA ใน RT-qPCR.
ใน qPCR หรือ PCR แบบเรียลไทม์, ตามชื่อที่แนะนำ, สามารถตรวจสอบการขยายได้ในขณะที่ PCR ดำเนินไป. ใน qPCR, การติดฉลากเรืองแสงช่วยให้สามารถรวบรวมข้อมูลแบบเรียลไทม์ได้ในขณะที่ทำปฏิกิริยาลูกโซ่โพลิเมอเรส.
สามารถตรวจพบผลิตภัณฑ์ PCR แบบเรียลไทม์ใน qPCR ได้สองวิธี:
การใช้สีย้อมเรืองแสงที่ไม่เฉพาะเจาะจงช่วยในการตรวจหา DNA ที่มีเกลียวสองเส้น. สีย้อมจับ dsDNA ให้สัญญาณเรืองแสงเมื่อ DNA ถูกขยาย, และจะเพิ่มขึ้นในแต่ละรอบ. ข้อเสียของวิธีนี้คือสามารถตรวจสอบเป้าหมายได้ครั้งละหนึ่งเป้าหมายเท่านั้น เนื่องจากมันเชื่อมโยงกับแฟรกเมนต์ dsDNA ทั้งหมด.
ใช้หัววัดดีเอ็นเอที่มีฉลากเรืองแสง, ซึ่งเป็นลำดับเฉพาะ. สามารถตรวจจับได้หลังจากการผสมพันธุ์ด้วยลำดับที่สมบูรณ์. เนื่องจากการตรวจดีเอ็นเอเป็นเป้าหมายเฉพาะ, สามารถวิเคราะห์เป้าหมายจำนวนมากพร้อมกันได้.
อาร์ที-พีซีอาร์คืออะไร?
RT-PCR หรือ PCR การถอดความแบบย้อนกลับประกอบด้วยสองขั้นตอน, ประการแรกคือกระบวนการถอดความแบบย้อนกลับ, และประการที่สองคือการขยายลำดับดีเอ็นเอที่ต้องการโดยปฏิกิริยาลูกโซ่โพลิเมอเรสหรือ PCR. RT-PCR ใช้เพื่อตรวจจับ RNA ในตัวอย่าง. สามารถวัดปริมาณของ RNA ได้โดยใช้ RT-qPCR. RT-PCR ร่วมกับ qPCR (RT-qPCR) มีประโยชน์อย่างมากในการวิเคราะห์เชิงปริมาณของ RNA ของไวรัสและการแสดงออกของยีน.
ขั้นตอนของ RT-PCR จะเหมือนกับ PCR, ด้วยขั้นตอนแรกเพิ่มเติมของการถอดความแบบย้อนกลับ. ในอาร์ที-พีซีอาร์, ดีเอ็นเอที่สมบูรณ์ (ซีดีเอ็นเอ) ถูกผลิตขึ้นก่อนโดยใช้รีเวิร์สทรานสคริปเทส (RT). ซีดีเอ็นเอ, จึงก่อตัวขึ้น, จากนั้นใช้เป็นแม่แบบสำหรับกระบวนการขยายมาตรฐานโดย PCR.
ความแตกต่างที่สำคัญระหว่าง PCR, RT PCR และ qPCR:
เนื้อหาข้างต้นสามารถสรุปตามประเด็นต่อไปนี้:
- PCR เป็นเทคนิคง่ายๆ ที่ใช้สร้างสำเนาชิ้นส่วน DNA ที่ต้องการหลายชุด. อาร์.ที.พีซีอาร์, ในทางกลับกัน, ใช้สำหรับขยาย RNA. ในทางตรงกันข้าม, qPCR เกี่ยวข้องกับการหาปริมาณกรดนิวคลีอิกในตัวอย่างที่เกี่ยวข้อง.
- PCR และ RT PCR เป็นเทคนิคเชิงคุณภาพ, แต่ qPCR เป็นเทคนิคเชิงปริมาณ.
- เทมเพลตเริ่มต้นสำหรับ PCR คือ DNA ที่มีเกลียวสองเส้น, ในขณะที่ RT PCR สามารถใช้ RNA เป็นแม่แบบได้เท่านั้น นอกเหนือจากนี้, qPCR มีความสามารถในการใช้ทั้ง DNA และ RNA.
- PCR เป็นเทคนิคที่มีความไวและความจำเพาะต่ำ. ในทางตรงกันข้าม, RT PCR และ qPCR มีความละเอียดอ่อนและเฉพาะเจาะจงมาก.
- ความละเอียดของผลิตภัณฑ์ที่ขยายใน PCR นั้นต่ำมาก. ในทางกลับกัน, ผลิตภัณฑ์ PCR ของ RT PCR และ qPCR มีระดับความละเอียดที่สูงกว่า.
- เฉพาะเอนไซม์ DNA polymerase เท่านั้นที่จำเป็นสำหรับ PCR แบบดั้งเดิม. แต่ RT PCR และ qPCR ต้องการทั้งเอนไซม์รีเวิร์สทรานสคริปเทสและดีเอ็นเอโพลิเมอเรส.
- พีซีอาร์, เช่น RT PCR, ไม่เกี่ยวข้องกับการเรืองแสง, แต่ qPCR ขึ้นอยู่กับหลักการของการเรืองแสงเป็นหลัก.
- ผลลัพธ์ของ PCR และ RT-PCR ได้เมื่อสิ้นสุดปฏิกิริยา, แต่ qPCR สร้างผลลัพธ์พร้อมกันในรูปแบบของจุดสูงสุดและกราฟ.
