ПЦР или полимеразная цепная реакция, представляет собой биотехнологический инструмент для амплификации интересующего гена. Простая ПЦР используется для обнаружения и амплификации гена. Существуют различные усовершенствованные методы ПЦР., которые используются для различных биотехнологических, диагностические и исследовательские цели. КПЦР или количественная ПЦР также известна как ПЦР в реальном времени.. qPCR используется для количественного определения нуклеиновых кислот. Амплификацию молекулы ДНК можно контролировать во время ПЦР., то есть. в настоящее время. ОТ-ПЦР называют полимеразной цепной реакцией с обратной транскрипцией.. Он использует оба процесса, то есть. обратная транскрипция и полимеразная цепная реакция. Он используется для обнаружения и измерения количества РНК.
Люди часто путают термины ПЦР, ОТ ПЦР, и QPCR так же. Но они не такие. Однако, основной принцип во всех трех типах остается одинаковым. Прежде чем перейти к различиям всех трех PCR, мы должны знать, что они на самом деле?
Что такое ПЦР?
Полимеразная цепная реакция или ПЦР используется для амплификации или получения нескольких копий гена или короткого участка ДНК.. Его изобрел Кэри Маллис.. Этот метод является очень полезным инструментом в молекулярной биологии и биотехнологии.. Он используется в лабораториях для создания миллиардов копий ДНК для исследований и диагностики.. ПЦР состоит из трех шагов: Денатурация, Отжиг праймеров и удлинение праймеров.
Для этого требуются два набора праймеров, комплементарных обоим концам ДНК-матрицы, и термостабильная ДНК-полимераза.. Цикл полимеразы многократно повторяется, чтобы получить несколько копий сегмента ДНК..
Три стадии полимеразной цепной реакции::
Денатурация: На этом шаге, двухцепочечная ДНК разделена. Образуются одиночные нити ДНК.
Отжиг: Температура реакции снижена, чтобы обеспечить комплементарное спаривание оснований и отжиг праймера..
Расширение: Taq-полимераза, которая представляет собой термостабильную ДНК-полимеразу, обычно используется для этой цели. ДНК-полимераза добавляет нуклеотиды к праймеру и удлиняет комплементарную цепь в направлении 5’-3’..
Что такое КПЦР?
КПЦР или количественная ПЦР также называется ПЦР в реальном времени.. Дает дополнительный количественный анализ ДНК или РНК в RT-qPCR..
В количественной ПЦР или ПЦР в реальном времени, как подсказывает название, амплификацию можно контролировать по мере прохождения ПЦР. В количественной ПЦР, флуоресцентная маркировка позволяет собирать данные в режиме реального времени по мере проведения полимеразной цепной реакции..
Продукты ПЦР могут быть обнаружены в режиме реального времени в qPCR двумя методами.:
Использование неспецифических флуоресцентных красителей помогает в обнаружении двухцепочечной ДНК.. Краситель, связывающий двухцепочечную ДНК, дает сигналы флуоресценции по мере амплификации ДНК., и увеличивается после каждого цикла. Недостатком этого метода является то, что одновременно можно исследовать только одну мишень, поскольку она связывается со всеми фрагментами двухцепочечной ДНК..
Использование ДНК-зондов с флуоресцентной меткой, которые специфичны для последовательности. Их можно обнаружить после гибридизации с комплементарной последовательностью.. Поскольку ДНК-зонды являются целевыми, можно анализировать множество целей одновременно.
Что такое ОТ-ПЦР?
ОТ-ПЦР или ПЦР с обратной транскрипцией включает два этапа., первый процесс обратной транскрипции, а второй – амплификация нужной последовательности ДНК с помощью полимеразной цепной реакции или ПЦР.. ОТ-ПЦР используется для обнаружения РНК в образце.. Количество РНК можно измерить с помощью RT-qPCR.. ОТ-ПЦР в сочетании с кПЦР (ОТ-кПЦР) очень полезен при проведении количественного анализа вирусной РНК и экспрессии генов.
Этапы ОТ-ПЦР такие же, как и ПЦР., с дополнительным первым этапом обратной транскрипции. В ОТ-ПЦР, комплементарная ДНК (кДНК) производится сначала с помощью обратной транскриптазы (РТ). кДНК, таким образом сформированный, затем используется в качестве шаблона для стандартного процесса амплификации с помощью ПЦР.
Ключевые различия между ПЦР, ОТ-ПЦР и кПЦР:
Вышеупомянутое содержание может быть резюмировано на основе следующего пункта:
- ПЦР — это простой метод, используемый для создания множества копий нужных фрагментов ДНК.. ОТ ПЦР, с другой стороны, используется для амплификации РНК. Напротив, qPCR участвует в количественном определении нуклеиновых кислот в соответствующем образце.
- ПЦР и ОТ-ПЦР являются качественными методами., но qPCR - это количественный метод.
- Исходной матрицей для ПЦР является двухцепочечная ДНК., в то время как RT PCR может использовать только РНК в качестве матрицы., qPCR может использовать как ДНК, так и РНК.
- ПЦР – метод с низкой чувствительностью и специфичностью. По сравнению, ОТ-ПЦР и кПЦР очень чувствительны и специфичны..
- Разрешение амплифицированного продукта в ПЦР ультранизкое. С другой стороны, продукты ПЦР ОТ-ПЦР и кПЦР имеют более высокий уровень разрешения.
- Для традиционной ПЦР требуется только фермент ДНК-полимераза.. Но для ОТ-ПЦР и количественной ПЦР требуются ферменты как обратной транскриптазы, так и ДНК-полимеразы..
- ПЦР, как ОТ ПЦР, не имеет отношения к флуоресценции, но qPCR в основном основан на принципе флуоресценции.
- Результаты ПЦР и ОТ-ПЦР получают в конце реакции, но qPCR генерирует результаты одновременно в виде пиков и графиков.
