PCR ou reação em cadeia da polimerase, é uma ferramenta biotecnológica para amplificar um gene de interesse. PCR simples é usado para a detecção e amplificação do gene. Existem vários métodos avançados de PCR, que são usados para vários processos biotecnológicos, diagnósticos e fins de pesquisa. qPCR ou PCR quantitativo também é conhecido como PCR em tempo real. qPCR é usado para quantificar os ácidos nucléicos. A amplificação da molécula de DNA pode ser monitorada durante a PCR, ou seja. em tempo real. RT-PCR é referido como uma reação em cadeia da polimerase com transcrição reversa. Ele utiliza os dois processos, ou seja. transcrição reversa e reação em cadeia da polimerase. É usado para detectar e medir a quantidade de RNA.
Muitas vezes as pessoas confundem os termos PCR, RT PCR, e QPCR como o mesmo. Mas eles não são tão iguais. No entanto, o princípio básico em todos os três tipos permanece o mesmo. Antes de ir para as diferenças de todos os três PCRs, devemos saber o que eles são realmente?
o que é PCR?
A reação em cadeia da polimerase ou PCR é usada para amplificar ou produzir múltiplas cópias de um gene ou trecho curto de DNA. Foi inventado por Kary Mullis. Esta técnica é uma ferramenta muito útil em biologia molecular e biotecnologia. É usado em laboratórios para fazer bilhões de cópias de DNA para pesquisa e diagnóstico. Existem três etapas no PCR: Desnaturação, Recozimento de primers e Extensão de primers.
Requer dois conjuntos de primers complementares a ambas as extremidades do molde de DNA e uma polimerase de DNA termoestável. O ciclo da polimerase é repetido repetidamente para obter várias cópias do segmento de DNA.
As três etapas da reação em cadeia da polimerase são:
Desnaturação: nesta etapa, o DNA de fita dupla é separado. Cadeias simples de DNA são formadas.
anelamento: A temperatura da reação é reduzida para permitir o emparelhamento de bases complementares e o recozimento do primer.
Extensão: Taq polimerase, que é uma DNA polimerase termoestável, é comumente usado para esta finalidade. A DNA polimerase adiciona nucleotídeos ao primer e estende a fita complementar na direção 5'-3'.
o que é qPCR?
qPCR ou PCR quantitativo também é conhecido como PCR em tempo real. Dá uma análise quantitativa adicional do DNA ou RNA em RT-qPCR.
Em qPCR ou PCR em tempo real, como o nome sugere, a amplificação pode ser monitorada à medida que a PCR progride. Em qPCR, a marcação fluorescente permite a coleta de dados em tempo real enquanto uma reação em cadeia da polimerase é realizada.
Produtos de PCR podem ser detectados em tempo real em qPCR por dois métodos:
O uso de corantes fluorescentes não específicos ajuda na detecção de DNA de fita dupla. O corante de ligação dsDNA fornece sinais de fluorescência à medida que o DNA é amplificado, e aumenta após cada ciclo. A desvantagem desse método é que apenas um alvo pode ser examinado por vez, pois se liga a todos os fragmentos dsDNA.
Usando sondas de DNA marcadas com fluorescente, que são específicos de sequência. Eles podem ser detectados após a hibridização com sua sequência complementar. Como as sondas de DNA são alvo específico, muitos alvos podem ser analisados simultaneamente.
O que é RT-PCR?
RT-PCR ou PCR de transcrição reversa compreende duas etapas, o primeiro é o processo de transcrição reversa, e a segunda é a amplificação da sequência de DNA desejada por reação em cadeia da polimerase ou PCR. RT-PCR é usado para detectar o RNA em uma amostra. A quantidade de RNA pode ser medida usando RT-qPCR. RT-PCR combinado com qPCR (RT-qPCR) é muito útil para fazer análises quantitativas de RNA viral e expressão gênica.
As etapas do RT-PCR são as mesmas do PCR, com a primeira etapa adicional de transcrição reversa. Em RT-PCR, DNA complementar (cDNA) é produzido primeiro usando a transcriptase reversa (RT). o cDNA, assim formado, é então usado como modelo para o processo de amplificação padrão por PCR.
Principais diferenças entre PCR, RT PCR e qPCR:
O conteúdo acima pode ser resumido com base no seguinte ponto:
- A PCR é uma técnica simples usada para criar várias cópias dos fragmentos de DNA desejados. RT PCR, por outro lado, é usado para amplificação de RNA. Pelo contrário, qPCR está envolvido na quantificação dos ácidos nucleicos na respectiva amostra.
- PCR e RT PCR são técnicas qualitativas, mas qPCR é uma técnica quantitativa.
- O molde inicial para a PCR é o DNA de fita dupla, enquanto RT PCR só pode usar RNA como modelo. Além destes, qPCR tem a capacidade de usar DNA e RNA.
- A PCR é uma técnica com baixa sensibilidade e especificidade. Em contraste, RT PCR e qPCR são muito sensíveis e específicos.
- A resolução do produto amplificado em PCR é ultrabaixa. Por outro lado, os produtos de PCR de RT PCR e qPCR têm um maior nível de resolução.
- Apenas a enzima DNA polimerase é necessária para a PCR tradicional. Mas RT PCR e qPCR requerem ambas as enzimas transcriptase reversa e DNA polimerase.
- PCR, como RT PCR, não tem relevância para a fluorescência, mas o qPCR é baseado principalmente no princípio da fluorescência.
- Os resultados de PCR e RT-PCR são obtidos no final da reação, mas o qPCR gera os resultados simultaneamente na forma de picos e gráficos.
