PCR o reazione a catena della polimerasi, è uno strumento biotecnologico per amplificare un gene di interesse. La PCR semplice viene utilizzata per il rilevamento e l'amplificazione del gene. Esistono vari metodi avanzati di PCR, che vengono utilizzati per varie biotecnologie, scopi diagnostici e di ricerca. qPCR o PCR quantitativa è anche nota come PCR in tempo reale. qPCR viene utilizzato per quantificare gli acidi nucleici. L'amplificazione della molecola di DNA può essere monitorata durante la PCR, cioè. in tempo reale. La RT-PCR viene definita reazione a catena della polimerasi a trascrizione inversa. Utilizza entrambi i processi, cioè. trascrizione inversa e reazione a catena della polimerasi. Viene utilizzato per rilevare e misurare la quantità di RNA.
Le persone spesso confondono i termini PCR, PCR RT, e QPCR come lo stesso. Ma non sono la stessa cosa. Tuttavia, il principio fondamentale in tutti e tre i tipi rimane lo stesso. Prima di passare alle differenze tra tutte e tre le PCR, dovremmo sapere cosa sono realmente?
Cos'è la PCR?
La reazione a catena della polimerasi o PCR viene utilizzata per amplificare o produrre più copie di un gene o di un breve tratto di DNA. È stato inventato da Kary Mullis. Questa tecnica è uno strumento molto utile nella biologia molecolare e nella biotecnologia. Viene utilizzato nei laboratori per creare miliardi di copie di DNA per la ricerca e la diagnostica. Ci sono tre passaggi nella PCR: Denaturazione, Ricottura ed estensione dei primer.
Richiede due serie di primer complementari ad entrambe le estremità dello stampo di DNA e una DNA polimerasi termostabile. Il ciclo della polimerasi viene ripetuto ripetutamente per ottenere più copie del segmento di DNA.
Le tre fasi della reazione a catena della polimerasi sono:
Denaturazione: In questo passaggio, il DNA a doppio filamento viene separato. Si formano singoli filamenti di DNA.
Ricottura: La temperatura di reazione viene ridotta per consentire l'accoppiamento complementare delle basi e la ricottura del primer.
Estensione: Taq polimerasi, che è una DNA polimerasi termostabile, è comunemente usato per questo scopo. La DNA polimerasi aggiunge nucleotidi al primer ed estende il filamento complementare nella direzione 5'-3'.
Cos'è la qPCR?
qPCR o PCR quantitativa viene anche definita PCR in tempo reale. Fornisce un'ulteriore analisi quantitativa del DNA o dell'RNA in RT-qPCR.
In qPCR o PCR in tempo reale, Come suggerisce il nome, l'amplificazione può essere monitorata man mano che la PCR procede. Nella qPCR, l'etichettatura fluorescente consente la raccolta dei dati in tempo reale mentre viene eseguita una reazione a catena della polimerasi.
I prodotti della PCR possono essere rilevati in tempo reale in qPCR con due metodi:
L'uso di coloranti fluorescenti non specifici aiuta a rilevare il DNA a doppio filamento. Il colorante legante il dsDNA fornisce segnali di fluorescenza quando il DNA viene amplificato, e aumenta dopo ogni ciclo. Lo svantaggio di questo metodo è che è possibile esaminare un solo target alla volta poiché si lega a tutti i frammenti di dsDNA.
Utilizzando sonde di DNA marcate con fluorescenza, che sono specifici della sequenza. Possono essere rilevati dopo l'ibridazione con la sua sequenza complementare. Poiché le sonde del DNA sono target specifici, molti target possono essere analizzati simultaneamente.
Cos'è la RT-PCR?
La RT-PCR o PCR a trascrizione inversa comprende due passaggi, il primo è il processo di trascrizione inversa, e il secondo è l'amplificazione della sequenza di DNA desiderata mediante reazione a catena della polimerasi o PCR. La RT-PCR viene utilizzata per rilevare l'RNA in un campione. La quantità di RNA può essere misurata utilizzando RT-qPCR. RT-PCR combinata con qPCR (RT-qPCR) è molto utile per eseguire analisi quantitative dell'RNA virale e dell'espressione genica.
I passaggi della RT-PCR sono gli stessi della PCR, con l'ulteriore primo passaggio della trascrizione inversa. Nella RT-PCR, DNA complementare (cDNA) viene prodotto per primo utilizzando la trascrittasi inversa (RT). Il cDNA, così formato, viene quindi utilizzato come modello per il processo di amplificazione standard mediante PCR.
Differenze chiave tra PCR, RT PCR e qPCR:
Il contenuto di cui sopra può essere riassunto in base al seguente punto:
- La PCR è una tecnica semplice utilizzata per creare copie multiple dei frammenti di DNA desiderati. PCR RT, d'altra parte, viene utilizzato per l'amplificazione dell'RNA. Anzi, La qPCR è coinvolta nella quantificazione degli acidi nucleici nel rispettivo campione.
- PCR e RT PCR sono tecniche qualitative, ma qPCR è una tecnica quantitativa.
- Il modello iniziale per la PCR è il DNA a doppio filamento, mentre la RT PCR può utilizzare solo l'RNA come modello. A parte questi, qPCR ha la capacità di utilizzare sia DNA che RNA.
- La PCR è una tecnica con bassa sensibilità e specificità. In contrasto, RT PCR e qPCR sono molto sensibili e specifici.
- La risoluzione del prodotto amplificato nella PCR è estremamente bassa. D'altra parte, i prodotti PCR di RT PCR e qPCR hanno un livello di risoluzione più elevato.
- Per la PCR tradizionale è richiesto solo l’enzima DNA polimerasi. Ma la RT PCR e la qPCR richiedono sia la trascrittasi inversa che gli enzimi della DNA polimerasi.
- PCR, come la RT PCR, non ha alcuna rilevanza per la fluorescenza, ma la qPCR si basa principalmente sul principio della fluorescenza.
- I risultati della PCR e della RT-PCR si ottengono al termine della reazione, ma qPCR genera i risultati simultaneamente sotto forma di picchi e grafici.
