पीसीआर या पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन, रुचि के जीन को बढ़ाने के लिए एक जैव प्रौद्योगिकी उपकरण है. सरल पीसीआर का उपयोग जीन का पता लगाने और प्रवर्धन के लिए किया जाता है. पीसीआर के विभिन्न उन्नत तरीके हैं, जो विभिन्न जैव प्रौद्योगिकी के लिए उपयोग किया जाता है, निदान और अनुसंधान के उद्देश्य. क्यूपीसीआर या मात्रात्मक पीसीआर को रीयल-टाइम पीसीआर के रूप में भी जाना जाता है. qPCR का उपयोग न्यूक्लिक एसिड की मात्रा निर्धारित करने के लिए किया जाता है. पीसीआर के दौरान डीएनए अणु के प्रवर्धन पर नजर रखी जा सकती है, अर्थात. वास्तविक समय में. RT-PCR को रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन के रूप में जाना जाता है. यह दोनों प्रक्रियाओं का उपयोग करता है, अर्थात. रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन और पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन. इसका उपयोग आरएनए की मात्रा का पता लगाने और मापने के लिए किया जाता है.
लोग अक्सर पीसीआर शब्द को लेकर भ्रमित हो जाते हैं, आरटी पीसीआर, और QPCR समान है. लेकिन वे वही नहीं हैं. हालाँकि, तीनों प्रकारों में मूल सिद्धांत समान रहता है. तीनों पीसीआर के अंतर पर जाने से पहले, हमें पता होना चाहिए कि वे वास्तव में क्या हैं?
पीसीआर क्या है?
पॉलीमरेज़ चेन रिएक्शन या पीसीआर का उपयोग जीन या डीएनए के छोटे खंड की कई प्रतियों को बढ़ाने या बनाने के लिए किया जाता है. इसका आविष्कार कैरी मुलिस ने किया था. यह तकनीक आणविक जीव विज्ञान और जैव प्रौद्योगिकी में एक बहुत ही उपयोगी उपकरण है. अनुसंधान और निदान के लिए डीएनए की अरबों प्रतियां बनाने के लिए प्रयोगशालाओं में इसका उपयोग किया जाता है. पीसीआर में तीन चरण होते हैं: विकृतीकरण, प्राइमर एनीलिंग और प्राइमरों का विस्तार.
इसके लिए डीएनए टेम्पलेट के दोनों सिरों और थर्मोस्टेबल डीएनए पोलीमरेज़ के पूरक प्राइमरों के दो सेटों की आवश्यकता होती है. डीएनए खंड की कई प्रतियां प्राप्त करने के लिए पोलीमरेज़ चक्र को बार-बार दोहराया जाता है.
पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन के तीन चरण हैं:
विकृतीकरण: इस चरण में, डबल स्ट्रैंडेड डीएनए को अलग किया जाता है. डीएनए की एकल किस्में बनती हैं.
एनीलिंग: प्राइमर के पूरक बेस पेयरिंग और एनीलिंग की अनुमति देने के लिए प्रतिक्रिया तापमान कम हो जाता है.
विस्तार: टाक पोलीमरेज़, जो एक थर्मोस्टेबल डीएनए पोलीमरेज़ है, आमतौर पर इस उद्देश्य के लिए प्रयोग किया जाता है. डीएनए पोलीमरेज़ प्राइमर में न्यूक्लियोटाइड जोड़ता है और पूरक स्ट्रैंड को 5'-3' दिशा में बढ़ाता है.
क्यूपीसीआर क्या है?
क्यूपीसीआर या क्वांटिटेटिव पीसीआर को रीयल-टाइम पीसीआर भी कहा जाता है. यह आरटी-क्यूपीसीआर में डीएनए या आरएनए का अतिरिक्त मात्रात्मक विश्लेषण देता है.
क्यूपीसीआर या रीयल-टाइम पीसीआर में, जैसा कि नाम सुझाव देता है, पीसीआर की प्रगति के रूप में प्रवर्धन की निगरानी की जा सकती है. क्यूपीसीआर में, फ्लोरोसेंट लेबलिंग रीयल-टाइम डेटा संग्रह की अनुमति देता है क्योंकि पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन किया जाता है.
पीसीआर उत्पादों को वास्तविक समय में क्यूपीसीआर में दो तरीकों से पता लगाया जा सकता है:
गैर-विशिष्ट फ्लोरोसेंट रंगों का उपयोग करने से दोहरे फंसे डीएनए का पता लगाने में मदद मिलती है. dsDNA बाइंडिंग डाई प्रतिदीप्ति संकेत देती है क्योंकि डीएनए प्रवर्धित होता है, और यह प्रत्येक चक्र के बाद बढ़ता है. इस पद्धति का नुकसान यह है कि एक समय में केवल एक ही लक्ष्य की जांच की जा सकती है क्योंकि यह सभी dsDNA अंशों को बांधता है.
फ्लोरोसेंट-लेबल डीएनए जांच का उपयोग करना, जो अनुक्रम-विशिष्ट हैं. इसके पूरक अनुक्रम के साथ संकरण के बाद उनका पता लगाया जा सकता है. चूंकि डीएनए जांच लक्षित विशिष्ट हैं, कई लक्ष्यों का एक साथ विश्लेषण किया जा सकता है.
आरटी-पीसीआर क्या है?
आरटी-पीसीआर या रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन पीसीआर में दो चरण होते हैं, पहली रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन प्रक्रिया है, और दूसरा पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन या पीसीआर द्वारा वांछित डीएनए अनुक्रम का प्रवर्धन है. नमूने में आरएनए का पता लगाने के लिए आरटी-पीसीआर का उपयोग किया जाता है. आरटी-क्यूपीसीआर का उपयोग करके आरएनए की मात्रा को मापा जा सकता है. qPCR के साथ संयुक्त RT-PCR (आरटी-क्यूपीसीआर) वायरल आरएनए और जीन एक्सप्रेशन का मात्रात्मक विश्लेषण करने में बहुत उपयोगी है.
आरटी-पीसीआर के चरण पीसीआर के समान ही हैं, रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन के अतिरिक्त पहले चरण के साथ. आरटी-पीसीआर में, पूरक डीएनए (सीडीएनए) रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस का उपयोग करके पहले उत्पादन किया जाता है (आर टी). सीडीएनए, इस प्रकार गठित, फिर पीसीआर द्वारा मानक प्रवर्धन प्रक्रिया के लिए एक टेम्पलेट के रूप में उपयोग किया जाता है.
पीसीआर के बीच मुख्य अंतर, आरटी पीसीआर और क्यूपीसीआर:
उपरोक्त सामग्री को निम्नलिखित बिंदु के आधार पर संक्षेपित किया जा सकता है:
- पीसीआर एक सरल तकनीक है जिसका उपयोग वांछित डीएनए अंशों की कई प्रतियां बनाने के लिए किया जाता है. आरटी पीसीआर, वहीं दूसरी ओर, आरएनए प्रवर्धन के लिए प्रयोग किया जाता है. इसके विपरीत, क्यूपीसीआर संबंधित नमूने में न्यूक्लिक एसिड के परिमाणीकरण में शामिल है.
- पीसीआर और आरटी पीसीआर गुणात्मक तकनीकें हैं, लेकिन क्यूपीसीआर एक मात्रात्मक तकनीक है.
- पीसीआर के लिए प्रारंभिक टेम्पलेट डबल स्ट्रैंडेड डीएनए है, जबकि RT PCR केवल RNA को टेम्पलेट के रूप में उपयोग कर सकता है। इनके अलावा, क्यूपीसीआर में डीएनए और आरएनए दोनों का उपयोग करने की क्षमता है.
- पीसीआर कम संवेदनशीलता और विशिष्टता वाली तकनीक है. इसके विपरीत, आरटी पीसीआर और क्यूपीसीआर बहुत संवेदनशील और विशिष्ट हैं.
- पीसीआर में प्रवर्धित उत्पाद का रिज़ॉल्यूशन अल्ट्रा-लो है. वहीं दूसरी ओर, RT PCR और qPCR के PCR उत्पादों में उच्च स्तर का रिज़ॉल्यूशन होता है.
- पारंपरिक पीसीआर के लिए केवल डीएनए पोलीमरेज़ एंजाइम की आवश्यकता होती है. लेकिन RT PCR और qPCR को रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस और डीएनए पोलीमरेज़ एंजाइम दोनों की आवश्यकता होती है.
- पीसीआर, आरटी पीसीआर की तरह, प्रतिदीप्ति से कोई संबंध नहीं है, लेकिन qPCR मुख्य रूप से प्रतिदीप्ति के सिद्धांत पर आधारित है.
- प्रतिक्रिया के अंत में पीसीआर और आरटी-पीसीआर के परिणाम प्राप्त होते हैं, लेकिन qPCR चोटियों और रेखांकन के रूप में एक साथ परिणाम उत्पन्न करता है.
