PCR ou réaction en chaîne par polymérase, est un outil biotechnologique pour amplifier un gène d'intérêt. La PCR simple est utilisée pour la détection et l'amplification du gène. Il existe différentes méthodes avancées de PCR, qui sont utilisés pour diverses biotechnologies, fins de diagnostic et de recherche. La qPCR ou PCR quantitative est également connue sous le nom de PCR en temps réel. La qPCR est utilisée pour quantifier les acides nucléiques. L'amplification de la molécule d'ADN peut être contrôlée pendant la PCR, c'est à dire. en temps réel. La RT-PCR est appelée réaction en chaîne par polymérase de transcription inverse. Il utilise les deux processus, c'est à dire. transcription inverse et réaction en chaîne par polymérase. Il est utilisé pour détecter et mesurer la quantité d'ARN.
Les gens confondent souvent les termes PCR, RT-PCR, et QPCR comme le même. Mais ce ne sont pas les mêmes. toutefois, le principe de base dans les trois types reste le même. Avant d'aborder les différences des trois PCR, nous devrions savoir ce qu'ils sont réellement?
Qu'est-ce que la PCR?
La réaction en chaîne par polymérase ou PCR est utilisée pour amplifier ou produire plusieurs copies d'un gène ou d'un court segment d'ADN. Il a été inventé par Kary Mullis. Cette technique est un outil très utile en biologie moléculaire et en biotechnologie. Il est utilisé dans les laboratoires pour fabriquer des milliards de copies d'ADN à des fins de recherche et de diagnostic.. Il y a trois étapes dans la PCR: Dénaturation, Recuit d'amorces et extension d'amorces.
Il nécessite deux ensembles d'amorces complémentaires aux deux extrémités de la matrice d'ADN et une ADN polymérase thermostable. Le cycle de la polymérase est répété à plusieurs reprises pour obtenir plusieurs copies du segment d'ADN.
Les trois étapes de la réaction en chaîne par polymérase sont:
Dénaturation: Dans cette étape, l'ADN double brin est séparé. Des brins simples d'ADN se forment.
Recuit: La température de réaction est réduite pour permettre l'appariement de bases complémentaires et l'hybridation de l'amorce.
Extension: Taq polymérase, qui est une ADN polymérase thermostable, est couramment utilisé à cette fin. L'ADN polymérase ajoute des nucléotides à l'amorce et étend le brin complémentaire dans la direction 5'-3'.
Qu'est-ce que la qPCR?
La qPCR ou PCR quantitative est également appelée PCR en temps réel. Il donne une analyse quantitative supplémentaire de l'ADN ou de l'ARN en RT-qPCR.
En qPCR ou PCR en temps réel, comme le nom le suggère, l'amplification peut être surveillée au fur et à mesure de la progression de la PCR. En qPCR, le marquage fluorescent permet la collecte de données en temps réel lors de la réalisation d'une réaction en chaîne par polymérase.
Les produits de PCR peuvent être détectés en temps réel en qPCR par deux méthodes:
L'utilisation de colorants fluorescents non spécifiques aide à détecter l'ADN double brin. Le colorant de liaison à l'ADNdb donne des signaux de fluorescence lorsque l'ADN est amplifié, et il augmente après chaque cycle. L'inconvénient de cette méthode est qu'une seule cible peut être examinée à la fois car elle se lie à tous les fragments d'ADNdb.
Utilisation de sondes d'ADN marquées par fluorescence, qui sont spécifiques à la séquence. Ils peuvent être détectés après hybridation avec sa séquence complémentaire. Comme les sondes d'ADN sont spécifiques à la cible, de nombreuses cibles peuvent être analysées simultanément.
Qu'est-ce que la RT-PCR?
La RT-PCR ou PCR de transcription inverse comprend deux étapes, le premier est le processus de transcription inverse, et la seconde est l'amplification de la séquence d'ADN souhaitée par réaction en chaîne par polymérase ou PCR. La RT-PCR est utilisée pour détecter l'ARN dans un échantillon. La quantité d'ARN peut être mesurée en utilisant la RT-qPCR. RT-PCR combinée à la qPCR (RT-qPCR) est très utile pour effectuer une analyse quantitative de l'ARN viral et de l'expression des gènes.
Les étapes de la RT-PCR sont les mêmes que celles de la PCR, avec la première étape supplémentaire de transcription inverse. En RT-PCR, ADN complémentaire (ADNc) est d'abord produit à l'aide de la transcriptase inverse (RT). L'ADNc, ainsi formé, est ensuite utilisé comme matrice pour le processus d'amplification standard par PCR.
Principales différences entre la PCR, RT PCR et qPCR:
Le contenu ci-dessus peut être résumé sur la base du point suivant:
- La PCR est une technique simple utilisée pour créer plusieurs copies des fragments d'ADN souhaités. RT-PCR, d'autre part, est utilisé pour l'amplification de l'ARN. Au contraire, La qPCR est impliquée dans la quantification des acides nucléiques dans l'échantillon respectif.
- La PCR et la RT PCR sont des techniques qualitatives, mais la qPCR est une technique quantitative.
- La matrice initiale pour la PCR est l'ADN double brin, tandis que la RT PCR ne peut utiliser que l'ARN comme modèle. En dehors de ces, qPCR a la capacité d'utiliser à la fois l'ADN et l'ARN.
- La PCR est une technique à faible sensibilité et spécificité. En revanche, La RT PCR et la qPCR sont très sensibles et spécifiques.
- La résolution du produit amplifié en PCR est ultra-faible. D'autre part, les produits PCR de RT PCR et qPCR ont un niveau de résolution plus élevé.
- Seule l'enzyme ADN polymérase est requise pour la PCR traditionnelle. Mais la RT PCR et la qPCR nécessitent à la fois des enzymes de transcriptase inverse et d'ADN polymérase.
- PCR, comme la RT-PCR, n'a aucun rapport avec la fluorescence, mais la qPCR est principalement basée sur le principe de la fluorescence.
- Les résultats de PCR et RT-PCR sont obtenus en fin de réaction, mais qPCR génère les résultats simultanément sous forme de pics et de graphiques.
