PCR oder Polymerase-Kettenreaktion, ist ein biotechnologisches Werkzeug zur Amplifikation eines interessierenden Gens. Einfache PCR wird zum Nachweis und zur Amplifikation des Gens verwendet. Es gibt verschiedene fortschrittliche Methoden der PCR, die für verschiedene biotechnologische verwendet werden, Diagnose- und Forschungszwecke. qPCR oder quantitative PCR wird auch als Real-Time-PCR bezeichnet. qPCR wird verwendet, um die Nukleinsäuren zu quantifizieren. Die Amplifikation des DNA-Moleküls kann während der PCR verfolgt werden, d.h. in Echtzeit. RT-PCR wird als reverse Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktion bezeichnet. Es nutzt beide Prozesse, d.h. Reverse Transkription und Polymerase-Kettenreaktion. Es wird verwendet, um die Menge an RNA nachzuweisen und zu messen.
Die Begriffe PCR werden oft verwechselt, RT-PCR, und QPCR als gleich. Aber das sind sie nicht. jedoch, das Kernprinzip bleibt bei allen drei Typen gleich. Bevor wir zu den Unterschieden aller drei PCRs gehen, wir sollten wissen, was sie eigentlich sind?
Was ist PCR?
Die Polymerase-Kettenreaktion oder PCR wird verwendet, um mehrere Kopien eines Gens oder eines kurzen DNA-Abschnitts zu amplifizieren oder zu produzieren. Es wurde von Kary Mullis erfunden. Diese Technik ist ein sehr nützliches Werkzeug in der Molekularbiologie und Biotechnologie. Es wird in Labors verwendet, um Milliarden von DNA-Kopien für Forschung und Diagnostik herzustellen. Es gibt drei Schritte in der PCR: Denaturierung, Primer-Annealing und Verlängerung von Primern.
Es erfordert zwei Sätze von Primern, die zu beiden Enden der DNA-Matrize komplementär sind, und eine thermostabile DNA-Polymerase. Der Polymerasezyklus wird wiederholt wiederholt, um mehrere Kopien des DNA-Segments zu erhalten.
Die drei Schritte der Polymerase-Kettenreaktion sind:
Denaturierung: In diesem Schritt, die doppelsträngige DNA wird getrennt. Einzelne DNA-Stränge werden gebildet.
Glühen: Die Reaktionstemperatur wird reduziert, um die komplementäre Basenpaarung und das Annealing des Primers zu ermöglichen.
Verlängerung: Taq-Polymerase, das ist eine thermostabile DNA-Polymerase, wird üblicherweise für diesen Zweck verwendet. Die DNA-Polymerase fügt dem Primer Nukleotide hinzu und verlängert den komplementären Strang in 5’-3’-Richtung.
Was ist qPCR?
qPCR oder quantitative PCR wird auch als Real-Time-PCR bezeichnet. Es liefert eine zusätzliche quantitative Analyse der DNA oder RNA in RT-qPCR.
In qPCR oder real-time PCR, wie der Name schon sagt, die Amplifikation kann überwacht werden, während die PCR fortschreitet. Bei qPCR, die fluoreszierende Markierung ermöglicht die Datenerfassung in Echtzeit, während eine Polymerase-Kettenreaktion durchgeführt wird.
PCR-Produkte können in Echtzeit in qPCR durch zwei Methoden nachgewiesen werden:
Die Verwendung unspezifischer Fluoreszenzfarbstoffe hilft beim Nachweis doppelsträngiger DNA. Der dsDNA-bindende Farbstoff gibt Fluoreszenzsignale, wenn die DNA amplifiziert wird, und es erhöht sich nach jedem Zyklus. Der Nachteil dieser Methode ist, dass immer nur ein Ziel untersucht werden kann, da es an alle dsDNA-Fragmente bindet.
Verwendung von fluoreszenzmarkierten DNA-Sonden, die sequenzspezifisch sind. Sie können nach Hybridisierung mit ihrer komplementären Sequenz nachgewiesen werden. Da die DNA-Sonden zielspezifisch sind, viele Ziele können gleichzeitig analysiert werden.
Was ist RT-PCR?
RT-PCR oder reverse Transkriptions-PCR umfasst zwei Schritte, Der erste ist der Reverse-Transkriptionsprozess, und die zweite ist die Amplifikation der gewünschten DNA-Sequenz durch Polymerase-Kettenreaktion oder PCR. RT-PCR wird verwendet, um die RNA in einer Probe nachzuweisen. Die Menge an RNA kann mit RT-qPCR gemessen werden. RT-PCR kombiniert mit qPCR (RT-qPCR) ist sehr nützlich bei der quantitativen Analyse von viraler RNA und Genexpression.
Die Schritte der RT-PCR sind die gleichen wie bei der PCR, mit dem zusätzlichen ersten Schritt der reversen Transkription. Bei RT-PCR, komplementäre DNA (cDNA) wird zuerst mit reverser Transkriptase produziert (RT). Die cDNA, so gebildet, wird dann als Matrize für das Standard-Amplifikationsverfahren durch PCR verwendet.
Hauptunterschiede zwischen PCR, RT-PCR und qPCR:
Der obige Inhalt kann basierend auf dem folgenden Punkt zusammengefasst werden:
- PCR ist eine einfache Technik, mit der mehrere Kopien der gewünschten DNA-Fragmente erstellt werden. RT-PCR, auf der anderen Seite, wird zur RNA-Amplifikation verwendet. Andererseits, Die qPCR ist an der Quantifizierung der Nukleinsäuren in der jeweiligen Probe beteiligt.
- PCR und RT-PCR sind qualitative Techniken, aber qPCR ist eine quantitative Technik.
- Die anfängliche Matrize für die PCR ist doppelsträngige DNA, während die RT-PCR nur RNA als Matrize verwenden kann. Abgesehen von diesen, qPCR kann sowohl DNA als auch RNA verwenden.
- PCR ist eine Technik mit geringer Sensitivität und Spezifität. Im Gegensatz, RT-PCR und qPCR sind sehr sensitiv und spezifisch.
- Die Auflösung des amplifizierten Produkts in der PCR ist extrem niedrig. Auf der anderen Seite, die PCR-Produkte der RT-PCR und qPCR haben eine höhere Auflösung.
- Für die traditionelle PCR wird nur das DNA-Polymerase-Enzym benötigt. Aber RT-PCR und qPCR erfordern sowohl Reverse-Transkriptase- als auch DNA-Polymerase-Enzyme.
- PCR, wie RT-PCR, hat keine Bedeutung für die Fluoreszenz, aber qPCR basiert hauptsächlich auf dem Prinzip der Fluoreszenz.
- Die Ergebnisse von PCR und RT-PCR werden am Ende der Reaktion erhalten, qPCR generiert die Ergebnisse jedoch gleichzeitig in Form von Peaks und Grafiken.
