تفاعل البوليميراز المتسلسل أو تفاعل البلمرة المتسلسل, هي أداة تكنولوجية حيوية لتضخيم الجين محل الاهتمام. يستخدم PCR البسيط للكشف عن الجين وتضخيمه. هناك العديد من الطرق المتقدمة لـ PCR, التي تستخدم في مختلف التقنيات الحيوية, أغراض التشخيص والبحث. يُعرف qPCR أو PCR الكمي أيضًا باسم PCR في الوقت الفعلي. يستخدم qPCR لتحديد الأحماض النووية. يمكن مراقبة تضخيم جزيء الحمض النووي أثناء تفاعل البوليميراز المتسلسل, أي. في الوقت الحقيقي. يشار إلى RT-PCR باسم تفاعل البوليميراز المتسلسل للنسخ العكسي. يستخدم كلا العمليتين, أي. النسخ العكسي وتفاعل البوليميراز المتسلسل. يتم استخدامه لاكتشاف وقياس كمية الحمض النووي الريبي.
غالبًا ما يخلط الناس بين مصطلحات PCR, RT PCR, و QPCR هو نفسه. لكنهم ليسوا نفس الشيء. لكن, يبقى المبدأ الأساسي في جميع الأنواع الثلاثة كما هو. قبل الانتقال إلى الاختلافات في جميع تقارير PCR الثلاثة, يجب أن نعرف ما هم في الواقع?
ما هو PCR?
يستخدم تفاعل البلمرة المتسلسل أو تفاعل البوليميراز المتسلسل لتضخيم أو إنتاج نسخ متعددة من الجين أو امتداد قصير من الحمض النووي. اخترعها كاري موليس. هذه التقنية هي أداة مفيدة للغاية في البيولوجيا الجزيئية والتكنولوجيا الحيوية. يتم استخدامه في المختبرات لعمل بلايين من نسخ الحمض النووي للبحث والتشخيص. هناك ثلاث خطوات في PCR: تمسخ, التمهيدي التلدين والتمديد من الاشعال.
يتطلب مجموعتين من المواد الأولية المكملة لكلا طرفي قالب الحمض النووي وبوليميراز DNA القابل للحرارة. تتكرر دورة البلمرة بشكل متكرر للحصول على نسخ متعددة من قطعة الحمض النووي.
الخطوات الثلاث لتفاعل البلمرة المتسلسل هي:
تمسخ: في هذه الخطوة, يتم فصل الحمض النووي مزدوج الشريطة. يتم تشكيل خيوط مفردة من الحمض النووي.
التلدين: يتم تقليل درجة حرارة التفاعل للسماح باقتران القاعدة التكميلية والتلدين من التمهيدي.
امتداد: طاق بوليميراز, وهو بوليميراز DNA ثابت حرارياً, يشيع استخدامه لهذا الغرض. يضيف بوليميراز الحمض النووي النيوكليوتيدات إلى البادئة ويمد الشريط التكميلي في اتجاه 5'-3 '.
ما هو QPCR?
يشار أيضًا إلى qPCR أو PCR الكمي باسم PCR في الوقت الحقيقي. يعطي تحليلاً كميًا إضافيًا للحمض النووي أو الحمض النووي الريبي في RT-qPCR.
في qPCR أو PCR في الوقت الحقيقي, حسب الاسم المقترح, يمكن مراقبة التضخيم مع تقدم PCR. في qPCR, يسمح وضع العلامات الفلورية بجمع البيانات في الوقت الفعلي حيث يتم إجراء تفاعل البلمرة المتسلسل.
يمكن اكتشاف منتجات PCR في الوقت الفعلي في qPCR بطريقتين:
يساعد استخدام الأصباغ الفلورية غير المحددة في اكتشاف الحمض النووي المزدوج الشريطة. تعطي صبغة ربط dsDNA إشارات مضان بينما يتم تضخيم الحمض النووي, ويزداد بعد كل دورة. عيب هذه الطريقة هو أنه يمكن فحص هدف واحد فقط في كل مرة لأنه يرتبط بجميع أجزاء dsDNA.
استخدام تحقيقات الحمض النووي الفلوريسنت المسمى, والتي هي محددة التسلسل. يمكن اكتشافها بعد التهجين بتسلسلها التكميلي. حيث أن تحقيقات الحمض النووي محددة الهدف, يمكن تحليل العديد من الأهداف في وقت واحد.
ما هو RT-PCR?
يتكون RT-PCR أو النسخ العكسي PCR من خطوتين, الأول هو عملية النسخ العكسي, والثاني هو تضخيم تسلسل الحمض النووي المطلوب عن طريق تفاعل البلمرة المتسلسل أو تفاعل البوليميراز المتسلسل. يستخدم RT-PCR للكشف عن الحمض النووي الريبي في عينة. يمكن قياس كمية الحمض النووي الريبي باستخدام RT-qPCR. RT-PCR مع qPCR (RT-QPCR) مفيد جدًا في إجراء التحليل الكمي للحمض النووي الريبي الفيروسي والتعبير الجيني.
خطوات RT-PCR هي نفسها خطوات PCR, مع الخطوة الأولى الإضافية للنسخ العكسي. في RT-PCR, الحمض النووي التكميلي (كدنا) يتم إنتاجه أولاً باستخدام النسخ العكسي (RT). [كدنا], وهكذا تشكلت, ثم يتم استخدامه كنموذج لعملية التضخيم القياسية بواسطة PCR.
الاختلافات الرئيسية بين PCR, RT PCR و qPCR:
يمكن تلخيص المحتوى أعلاه بناءً على النقطة التالية:
- PCR هي تقنية بسيطة تُستخدم لإنشاء نسخ متعددة من أجزاء الحمض النووي المرغوبة. RT PCR, على الجانب الآخر, يستخدم لتضخيم الحمض النووي الريبي. على العكس تماما, يشارك qPCR في القياس الكمي للأحماض النووية في العينة المعنية.
- PCR و RT PCR هي تقنيات نوعية, لكن qPCR هي تقنية كمية.
- القالب الأولي لـ PCR هو DNA مزدوج الشريطة, بينما يمكن لـ RT PCR استخدام RNA فقط كقالب ، بصرف النظر عن هؤلاء, qPCR لديه القدرة على استخدام كل من DNA و RNA.
- PCR هي تقنية ذات حساسية وخصوصية منخفضة. في المقابل, RT PCR و qPCR حساسان للغاية ومحددان.
- دقة المنتج المضخم في PCR منخفضة للغاية. على الجانب الآخر, تتمتع منتجات PCR الخاصة بـ RT PCR و qPCR بمستوى أعلى من الدقة.
- مطلوب فقط إنزيم بوليميراز DNA من أجل PCR التقليدي. لكن RT PCR و qPCR يتطلبان كلاً من إنزيمات النسخ العكسي والبوليميراز DNA.
- PCR, مثل RT PCR, لا علاقة له باللمعان, لكن qPCR يعتمد بشكل أساسي على مبدأ التألق.
- يتم الحصول على نتائج PCR و RT-PCR في نهاية التفاعل, لكن qPCR يولد النتائج في وقت واحد في شكل قمم ورسوم بيانية.
